雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒   

 （增強型）

一、運輸與存儲條件。

   本產品必須干冰運輸，依據各組份保存條件分開保存，有效期2年。

二、注意事項（請使用試劑盒前閱讀此注意事項）。

1.    由于酶促反應受溫度影響，所以待測樣品（細胞裂解產物）和分裝的螢火蟲螢光素酶檢測試劑必須平衡到室溫后再進行活性測定，否則同一樣品在不同溫度下檢測到的活性值差異較大。

2.    螢火蟲螢光素酶檢測試劑不可反復凍融，可分裝成100 μl/管，置于-80 ℃長期保存。

3.    用ddH₂O將5 × 細胞裂解液稀釋成1 × 細胞裂解液，再裂解細胞。1 × 細胞裂解液可在4 ℃存放1周，長期保存在-20 ℃。

4.    為取得最佳測定效果，用單管的化學發光儀測定樣品活性時，樣品加入底物時的間隔時間和混合次數盡量一致，減少操作誤差；使用多功能化學發光酶標儀時，宜先把樣品全部加好，再統一加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

5.    海腎螢光素酶的底物腔腸素溶液是乙醇溶液，易揮發。收到產品時若發現其體積小于0.2 ml，可自行添加適當的無水乙醇補齊體積為0.2 ml。

6.    配制好的海腎螢光素酶檢測試劑，請立即使用，或者-80 ℃保存。-20 ℃保存導致效果減弱。

7.    SFAR Buffer若有沉淀，可以在室溫平衡一段時間，待沉淀溶解后再使用。

8.    SFAR Buffer配制的海腎螢光素酶活性檢測試劑加入可以檢測體系后，可以滅活螢火蟲螢光素酶的活性，啟動海腎螢光素酶的活性測定。

9.    SFAR Buffer只用于雙螢光素酶報告基因檢測體系，若單獨檢測海腎螢光素酶活性，請購買本公司的“海腎螢光素酶報告基因檢測試劑盒（增強型）（Omt-08）”，利用其中的腔腸素稀釋液配制的檢測試劑可以直接檢測海腎螢光素酶的活性，且檢測到的活性值較高。

10. 為了您的健康，實驗過程中請穿好實驗服、佩戴手套和安全眼鏡。

三、產品簡介。

本產品由螢火蟲螢光素酶檢測試劑和海腎螢光素酶檢測試劑組成，在同一體系中依次測定兩種螢光素酶的活性，從而實現雙螢光素酶報告基因的檢測。

本產品是增強型的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，靈敏度是普通型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒的3-10倍，更適合檢測報告基因活性變化微弱的樣品。

四、特點與優勢。

1.     本試劑靈敏度高于市售同類試劑，靈敏度達到10^-19摩爾螢光素酶，線性范圍至少達到7個數量級酶濃度范圍，可以有效的檢測報告基因轉錄水平變化。

2.     本試劑盒操作簡單，能夠快速完成雙螢光素酶報告基因檢測。

五、使用說明。

1.    以6孔細胞培養板培養的貼壁細胞為處理對象，實驗步驟如下：

2.    細胞轉染。細胞轉染實驗請參考本公司轉染試劑（Omifection，Cat：Omc-01）說明書中的實驗步驟，將編碼螢火蟲螢光素酶基因的質粒與編碼海腎螢光素酶基因的質粒按10:1（或5:1）的比例混合，轉入6孔板的細胞中，2 μg/孔。

3.    裂解液配制。用ddH₂O稀釋5×細胞裂解液，配成1×細胞裂解液，4 ℃可存放1周。

4.    細胞裂解。細胞轉染后48 h，棄培養液，預冷的PBS洗滌細胞1次，加入0.5 ml細胞裂解液（1×），置于4 ℃搖床上，輕輕旋轉15-30 min，裂解細胞。

5.    將裂解液轉入1.5 ml EP管中，12,000×g，4 ℃離心5 min，棄沉淀，上清轉移至新的EP管中，即為待測樣品（細胞裂解產物）。

6.    海腎螢光素酶檢測試劑配制。每個樣品需要100 μl海腎螢光素酶檢測試劑。根據樣品數量，按照海腎螢光素酶底物:SFAR Buffer=1:50的比例配制海腎螢光素酶檢測試劑。

7.    活性測定。打開檢測儀器，設置測定參數，一般延遲時間（整合時間）為2 sec，測定時間為10-20 sec。吸取100 μl螢火蟲螢光素酶檢測試劑，加入EP管（或96孔板）中，再加入2-10 μl待測樣品（細胞裂解液），快速混勻，測定螢火蟲螢光素酶活性值。同一檢測體系中再加入100 μl海腎螢光素酶檢測試劑，快速混勻，測定海腎螢光素酶活性值。

8.    整理并分析螢火蟲螢光素酶活性值與海腎螢光素酶活性值的比例，鑒定目的基因表達變化。

表1. 細胞裂解液體積表

七、常見問題與分析。